Premessa.
La fosforilazione ossidativa rappresenta il culmine del metabolismo energetico negli organismi aerobici; tutte le tappe enzimatiche della degradazione ossidativa dei carboidrati, acidi grassi e amminoacidi nelle cellule aerobiche convergono sulla tappa finale della respirazione cellulare, in cui gli elettroni passano dagli intermedi catabolici all’ossigeno, generando l’energia necessaria alla sitesi da ATP da ADP e Pi.
Le nostre conoscenze sulla sintesi di ATP nei mitocondri e nei cloroplasti sono essenzialmente basate sull’ipotesi, proposta da Peter Mitchell nel 1961, in cui la trasduzione energentica avviene mediante la creazione di gradienti protonici transmembrana, conosciuta come teoria chemiosmotica e universalmente accettata.
Il processo della fosforilazione ossidativa ha origine nella catena di trasporto degli elettroni situata nei mitocondri; questi sono organelli delle cellule eucariotiche, la membrana mitocondriale esterna è facilemente permeabile a piccole molecole e a ioni; molti canali costituiti dalla proteina porina consnetono di attraversare la membrana alla maggior parte delle molecole con una massa molecolare a 5.000 u.
La membrana mitocondriale interna è impermeabile a quasi tutti gli ioni e piccole molecole, compreso i protoni H+ ; le sole specie chimiche che possono attraversare la membrana sono quelle che possiedono uno specifico trasportatore inserito nelle membrana stessa; in questa struttura sono localizzati anche i componenti della catena respiratoria e il complesso enzimatico che sintetizza ATP.
La maggior parte degli elettroni che entrano nella catena respiratoria mitocondriale è il frutto dell’azione di deidrogenasi che partecipano a reazioni come l’ossidazione del piruvato, il ciclo dell’acido citrico, la ?-ossidazione degli acidi grassi e le tappe ossoidative del catabolismo degli amminoacidi.
La catena respiratoria mitocondriale è costituita da una serie di trasportatori di elettroni, la maggior parte dei quali sono proteine integrali di membrana, contenenti gruppi prostetici in gradi di accettare e di donare uno o due elettroni.
Alcune delle reazioni della sequenza della catena respiratoria comportano il trasferimento di un solo elettrone, mentre in altre vie vi è il trasferimento contemporaneo di due elettroni; oltre al NAD e alle flavoproteine, nella catena respiratoria operano altri tre gruppi di tasportatori di elettroni: un benzochinone idrofobico (ubichinone) e due tipi diverse di proteine contenenti ferro i citocromi e le proteine ferro-zolfo).
Ubichinone.
È un benzochinone con una catena laterale isoprenoide molto lunga, può accettare un solo elettrone trasformandosi in un radicale semichinoco, oppure due elettroni acquisendo la forma completamente ridotta di ubichinolo (UQH2).
Come le flavoproteine è in grado di congiungere processi a due elettroni con altri a un solo elettrone; poiché l’ubichinone è piccolo come dimensioni e idrofobico, è liberamente diffusibile nel doppio strato lipidico della membrana mitocondriale interna e può agire da ponte tra trasportatori di elettroni meno mobili nella stessa membrana.
Citocromi..
Vi sono tre classi di citocromi distinguibili in base agli spettri di assorbimento della luce e indicati con le lettere a, b, c; ogni tipo di citoscomo nel suo stato ridotto (Fe2+) ha tre bande di assorbimento della luce nel campo visibile. Il gruppo eme dei citocromi tipo a e b è saldamente legato alla proteina, ma non con legami covalenti; il gruppo eme dei citocromi tipo c è invece legato covalentemente attraverso residui di Cys della proteina. Come per le flavoproteine, il potenziale di riduzione standard dell’atomo di ferro all’interno del gruppo eme dipende fortemente dalle sue interazioni con le catene laterali dei residui della proteine e quindi risulta diverso in ogni tipo di citocromo.
I citocromi del tipo a e b , ed alcuni del tipo c, sono proteine integrali di membrana.
Vedi figure sotto riportate.
I gruppi prostetici dei citocromi hanno quattro anelli a cinque membri, contenenti azoto, disposti in una struttura ciclica , chiamata porfirina.
I quattro atomi di azoto sono coordinati con un atomo di ferro che può assumere gli stati di ossidazione 2+ o 3+ ; la ferroprfirina IX si trova nei citocromi di tipo b, nella mioglobina e nell’emoglobina.
L’eme C è legato covalentemente alla proteina del citocromo c mediante ponti tioetere a due residui di Cys;
l’eme A, presente nei citocromi di tipo a, ha una lunga coda isoprenoide legata a uno degli anelli a cinque atomi membri.
I legami doppi coniugati (ombreggiati in rosso) della porfirina sono responsabili dell’assorbimento della luce visibile da parte di queste strutture.
Proteine ferro-zolfo.
Il ferro non è presente all’interno di un gruppo emem (come nei citocromi) ma è associato ad atomi di zolfo di residui di Cys della proteina; queste proteine partecipano a reazioni redox in cui viene trasferito un elettrone per volta, utilizzando cambi dello stato di ossidazione dei loro atomi di ferro.
I centri Fe-S delle proteine Ferro-Zolfo possono essere semplici come in a), con un solo ione Fe circondato da quattro residui di Cys;
altri tipi di centro comprendono sia residui di Cys che atomi di zolfo inorganico, come nei centri eFe-2S b) e 4Fe-aS c).
La ferrodossina d), isolata dal cianobatterio Spirullina platensis, ha due centri 2Fe-2S. Il potenziale di riduzione stabdard del Ferro in questi centri dipende dal tipo di centro e dalle specifiche interazioni che ha con la proteina che è inserito.
Nella reazione complessiva catalizzata dalla catena respiratoria dei mitocondri, gli elettroni passano dal NADH, dal succinato, o qualche altro donatore primario di elettroni, attraverso flavoproteine, ubichinone, proteine ferro zolfo e citocromi (praticamente tutti questi composti sono imersi nella membrana mitocondriale) per arrivare alla fine all’ossigeno.
Via degli elettroni nella fosfossidazione.
Complesso I: da NADH all’ubichinone:
il complesso I, detto anche complesso della NADH deidrogenasi, è una flavoproteina complessa contenente più di 25 catene polipeptidiche, l’intero complesso è immerso nella membrana mitocondriale interna e orientato con il sito che lega il NADH che guarda verso la matrice, in modo da poter interagire con il NADH prodotto dalle diverse deidrogenasi presenti in questo compartimento mitocondriale.
La reazione complessiva catalizzata dal complesso I è: NADH + H+ + UQ « NAD+ +UQH2 in cui l’ubichinone ossidato accetta uno ione idruro (due eletroni e un protone) dal NADH e un protone dal solvente acquoso della matrice;
il complesso enzimatico trasferisce prima una coppia di equivalenti riducenti dal NADH al suo gruppo prostetico FMN all’ubichinone.
Complesso II: da succunato a ubichinone:
anche se è più piccolo e più semplice del complesso I, contiene due tipi di gruppi prostetici e almeno quattro proteine diverse; si pensa che gli elettroni passino dal succinato al FAD e poi attraverso i centri Fe-S all’ubichinone.
La vie seguita dagli elettroni per passare dal NADH, succinato, acil-CoA e glicerolo-3-fosfato all’ubichinone.
Gli elettroni passano dal NADH a una flavoproteina e poi a una serie di proteine ferro-zolfo (nel complesso I) ed infine all’UQ.
Dal succinato, gli elettroni, attraverso una flavoproteina e diversi centri ferro-zolfo (nel cpmplesso II), arrivano ll’UQ;
il glicerolo 3-fosfato dona i suoi elettroni a una flavoproteina (glicerolo-3-fosfato deidrogenasi) sulla superficie esterna della membrana mitocondriale interna , che poi li trasferisce all’UQ.
L’acil-CoA deidrogenasi, il primo enzima della b- ossidazione, dona elettroni alla flavoproteina che li trasferisce all ETFP che poi li cede all’UQ attraverso ETFPubichinone ossidoreduttasi.
Complesso III: a ubichinone a citocromo c:
il complesso III funziona come una pompa protonica per effetto della distribuzione asimmentrica del complesso, i protoni che si liberano quando l’UQH2 viene ossidato sono rilasciati nello spazio intermmbrana, generando una differenza nella concentrazione protonica transmembrana, cioè un gradiente protonico.
La via degli elettroni attraverso il complesso III genera probabilmente un ciclo Q come quello mostrato in figura (frecce blu);
le frecce tratteggiate rappresentano le vie di diffusione dell’UQH2 (ubichinolo) o della sua forma ossidata UQ all’interno della membrana.
Gli effetti di queste reazioni sono:
- movimento degli elettroni dall’ubichinolo al citocromo c;
- movimento dei protoni dal lato interno (matrice) al lato esterno (citosolico) della membrana mitocondriale interna (lo spazio intermembrana).
Complesso IV: riduzione dell’O2:
è chiamato anche citocromo ossidasi, è costituito dai citocromi a e a3, che sono due gruppi eme legati in regioni diverse nella stessa proteina e sono quindi spetralmente e funzionalmente distinti.
Flusso di elettroni nel complesso IV.
Lo ione CuA (Cu2+) e il cit a (Fe3+) formano un centro redox dimetallico capace di accettare due elettroni; il CuB e il cit a3 costituiscono un altro centro redox in grado di accettare due elelttroni.
Non è ancora nota con precisione la via percorsa dagli elettroni dal cil c all’ossigeno; sembra che il primo elettrone passi dal cit c la CuA o al cit a, che sono in equilibrio;
questo centro dimetallico dona poi elettroni ai componenti dell’altro centro dimetallico, anc’esso in equilibrio. Di qui gli elettroni passano all’O2 che viene ridotto ad acqua;
i quattro protoni usati nella riduzione dell’ossigeno ad acqua vengono presi dal latoi della membrana mitocondriale interna rivolto verso la matrice.
Di conseguenza, la citocromo ossidasi pompa protoni fuori dalla matrice quando trasferisce elettroni all’ossigeno.
In sintesi la rappresentazione schematica del flusso degli elettroni è descritto nella figura sotto riportata.
Gli elettroni raggiungono l’UQ attraverso i complessi I o II;
l’UQH2 si comporta da trasportatore mobile di elettroni e di protoni. Trasferisce elettroni al complesso III, i quali poi arrivano a un altro trasportatore mobile, il citocromo c;
il complesso IV passa glie elttroni dal citocromo c all’O2.
Il flusso di elettroni attraverso i complessi I, III e IV è accompagnato da una traslocazione di protoni dalla matrice allo spazio intermembrana.
ATP sintasi.
Il complesso enzimatico che sintetizza l’ATP nella membrana interna dei mitocondri, è formato da due componenti principali chiamati F0 e F1 ; F1 , che in tutti gli ornasimi aerobici è costituito da sei subunità proteiche, contiene diversi siti di legame per l’ATP e ADP, compreso il siito catlitico in cui avviene la sintesi di ATP.
È un complesso proteico periferico integrale di membrana, composto da quattro polipeptidi diversi che formano un canale transmembrana attraverso il qaule possono passare i protoni; fotografie al microscopio elettronico ad alta risoluzione del complesso F0F1 hanno mostrato che la struttura ha la forma di un pomello dove F1 è la testa globulare e F0 è la base, normalmente inserita nella membrana.
Teoria chemiosmotica.
Il trasferimento degli elettroni lungo la catena respiratoria è accompagnato da un pompaggio di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna, che porta alla formazione di una differenza di concentrazione in protoni e quindi di Ph; la faccia che guarda verso la matrice della membrana diventa alcalina rispetto al lato citosolico della membrana stessa. In linea generale l’energia elettrochimica di un gradiente transmembrana di una qualsiasi specie carica può essere considerata alla stregua di un legame chimico;
l’energia conservata in questo gradiente è formata da due componenti: uno è l’energia potenziale chimica dovuta alla differenza di concentrazione della specie chimnica nelle due regioni separate da una membrana l’altro è l’energia del potenziale elettrico che si genera dalla separazione delle carche prodotta da uno ione che attraversa la membrana, senza che vi sia un flusso contrario di pari carica.
Gli elettroni presenti sul NADH o su altri substrati ossidabili passano attraverso una catena di trasportatori (citocromi, ecc.) disposti in modo assimmetrico nella membrana. Il flusso di elettroni è accompagnato da una traslocazione di protoni attraverso la membrana mitocondriale producendo un gradiente chimico (DpH) ed elettrico (Dy).
La membrana mitocondriale interna è impermeabile ai protoni e per rientrare questi devono attraversare i canali proteici specifici del complesso F0; la forma motrice protonica che spinge i protoni verso la matrice fornisce l’energia per la sintesi di ATP, catalizzata dal complesso F1 associato ad F0.
La membrana mitocondriale interna separa due compartimenti a pH diversi, con differenze quindi sia nella concentrazione di H+ (DpH) sia nella distribuzione delle cariche che genera un potenziale elettrico (Dy). Queste differenze genrano la forza motrice protonica (DG) che può essere calcolata come è mostrato nella figura sotto riportata.
Meccanismi molecolari della formazione di ATP.
Anche se è ormai chiaro che il gradiente transmembrana di protoni fornisce l’energia per la sintesi di ATP, non stato ancora identificato come questa energia viene trasmessa all’ATP sintasi.
Ogni complesso F1 ha una composizione in subunità del tipo a3 b3 y d e; il sito che lega saldamente l’ATP, apparentemente identico al sito catalitico, si trova sulla subunità b o forse nell’interfaccia tra le subunità b e a.
Ogni complesso F1 ha tree siti che possono sintetizzare ATP, che interagiscono con F0 mediante le singole coppie delle subunità y, d, e; in base ai dati cinetici dettagliati e a studi di legame delle reazioni catalizzate dal complesso F0F1, Paul Boyer suggerì un meccanismo come quello riportato in figura.
Modello proposto per il meccanismo d’azione dell’ATP sintasi.
L’enzima possiede tre siti di legame dei nucleotidi adeninici tra loro equivalenti, prresenti a livello delle interfacce tra le coppie di suunità a e b;
in un dato momento, uno dei tre siti è nella conformazione T (legame forte), un altro è nella conformazione L (legame debole) e il terzo è nella conformazione O (legame molto debole).
All’inizio di un ciclo catalitico, il sito T è occupato da una molecola di ATP, mentre il sito L lega debolmente ADP e Pi. La forza motrice protonica determina, forse mediante il flusso dei protoni attraverso il canale F0 , una modificazione confomazionale dell’enzima F1 in cui il sito T si converte in un sito O, con conseguente dissociazione dell’ATP e il sito L si converte in un sito T, dove ADP e Pi si condensano per formare ATP.
Il sito O diventa un sito L e lega anche se debolmente ADP e Pi; per definire le proprietà di questo enzima e necessario quindi che si completi almeno un certo numero di cicli ctalitici. LìATP non può essere rilasciato da un sito se ad un altro sito non vi sono legati ADP e Pi.
La funzione principale di trasferimento degli elettroni nei mitocondri è quello di fornire energia per la sintesi di ATP durante la fosforilazione ossidativa, am questa energia può servire anche a favorire diversi processi di trasporto che sono essenziali per la fosforilazione ossidativa.
I sistemi di trasporto nella membrana mitocondriale interna sono descritti nella figura sotto riportata.
L’ATP-ADP traslocasi è un antiporto:
la stessa proteina trasferisce l’ADP nella matrice e l’ATP all’esterno. Il trasporto, sostituendo una molecola di ATP4- con una di ADP3- , risulta in un eflusso di cariche negative, favorita dal fatto che la matrice è più negativa rispetto all’esterno.
A pH 7, Pi è presente sia sotto forma di HPO4 – – che di H2PO4 – ; il sistema di trasporto che trasferisce Pi nella matrice è specifico per la forma H2PO4.
Durante l’azione di questo simporto di H2PO4 – e di H+ non vi è un flusso di carche netto, ma la bassa concentrazione di protoni nella matrice favorisce il passaggio degli ioni.
Quindi la forza motrice protonica fornisce l’energia necessaria alla sintesi di ATP da parte dell’ATP L’ATP-ADP traslocasi è un antiporto; la stessa proteina trasferisce l’ADP nella matrice e l’ATP all’esterno.
Il trasporto, sostituendo una molecola di ATP4- con una di ADP3- , risulta in un eflusso di cariche negative, favorita dal fatto che la mtrice è più negativa rispetto all’esterno. A pH 7, Pi è presente sia sotto forma di HPO4 – – che di H2PO4 – ; il sistema di trasporto che trasferisce Pi nella matrice è specifico per la forma H2PO4 -.
Durante l’azione di questo simporto di H2PO4 – e di H+ non vi è un flusso di carche netto, ma la bassa concentrazione di protoni nella matrice favorisce il passaggio degli ioni. Quindi la forza motrice protonica fornisce l’energia necessaria alla sintesi di ATP da parte dell’ATP sintasi, ma coopera anche a trasportare i substrati (ADP e Pi) enella matrice e i prodotti (ATP) fuori dai mitocondri.
La NADH deidrogenasi della membrana mitocondriale interna delle cellule animali accetta elettroni solo da NADH presente nella matrice; dato che la membrana interna non è permeabile al NADH citosolico, speciali sistemi navetta (shuttle) trasportano gli equivalenti riducenti dal NADH citosolico all’interno dei mitocondri mediante una via uindiretta, come illustrato nella figura sotto riportata.
Spiegazione della figura sopra riportata.
- il NADH citosolico (spazio intermembrana) passa i suoi equivalenti riducenti all’ossalacetato, fromando malato.
- il malato viene trasportato all’interno attraverso la membrana del trasportatore malato-a-chetoglutarrato.
- nella matrice il malato trasferisce i suoi equivalenti riducenti al NAD+ ; il NADH così genrato viene poi riossidato dalla catena respiratoria mitocondriale; l’ossalacetato, il prodotto di ossidazione del malato, non può ritornare direttamente nel citosol e quindi viene prima tansaminato ad aspartato.
- che può uscire dai mitocondri attraverso il trasportatore glutamato-aspartato.
- ossalacetato viene rigenerato nel sitosol.
- il ciclo è così completato.
Nel muscolo scheletrico e nel cervello opera un altro tipo di sistema navetta, chiamato shuttle del glicerolo-3-fosfato, come illustrato nella figura riportata a sinistra.
Il diossiacetone fosfato nel citosol accetta due equivalenti riducenti dal NADH citosolico in una reazione catalizzatta dalla glicerolo-3-fosfato deidrogenasi, anche essa citosolica.
Un isozima della della glicerolo-3-fosfato deidrogenasi legato alla faccia esterna della membrana mitocondriale interna trasferisce poi due equivalenti riducenti del glicerolo-3-fosfato presenti nello spazio intermembrana, all’ubichinone. Da notare che questo shuttle non coinvolge sistemi di trasporto attraverso la membrana.
Regolazione della produzione di ATP.
Le principali vie cataboliche (glicolisi, ciclo dell’acido citrico, ossidazione degli acidi grassi e degli amminoacidi e fosforilazione ossidativa) sono interconnesse e concertate da meccanismi di regolazione che consentono loro di funzionare insieme in maniera economica e autoregolata per produrre ATP e precursori biosintetici.
Concentrazioni elevate di ATP (oppure basse di ADP e AMP) producono un rallentamento nella glicolisi, nell’ossidazione del piruvato e dell’ossidazione dell’acetato attraverso il ciclo dell’acidi citrico e la fosforilazione ossidativa.
Le quattro vie tendono ad accelerare la loro velocità quando vi è un aumento dell’utilizzazione di ATP e quindi delle concentrazioni di ADP, AMP, Pi; l’azione del citrato nell’inibire la glicolisi, si coordina con quella dei nucleotidi adeninici. Inoltre un aumento dei livelli di NADH e di acetil-CoA porta all’inibizione dell’ossidazione del piruvato ad acetil-CoA e un rapporto (NADH)/(NAD+) molto elevato è un segnale negativo per le deidrogenasi del ciclo dell’acido citrico.
Vi è una eccezione alla regola generale che dice la respirazione rallenta quando il rifornimento di ATP nella cellula è sufficiente; nella maggior parte degli animali, compreso l’uomo, i neonati hanno un tipo di tessuto adiposo chiamato grasso bruno, in cui l’ossidazione delle sostanze nutrienti non viene utilizzata per produrre ATP, ma per generare calore che serve a mantenere il corpo ad una tenperatura costante.
In molti tipi di cellule tumorali, la coordinazione crociata descritta sembra essere difettosa: la glicolisi procede ad una velocità più elevata di quella che sarebbe richiesta dal ciclo dell’acido citrico. Le cellule tumorali utilizzano molto più glucosio di quelle normali, ma non ossidano l’eccesso di piruvato prodotto dalla glicolisi, anche in presenza di ossigeno.
Per riossidare il NADH citosolico, la maggior parte del piruvato viene ridotto a lattato che poi esce da queste cellule e ritorna nel sangue. Inoltre alcune di queste cellule tumorali esprimono in grandi quantità un isoenzima dell’esochinasi che aderisce alla faccia esterna della membrana mitocondriale interna e diventa insensibile all’inibizione da prodotto.
Questo enzima può monopolizzare tutto l’ATP prodotto dalla cellula, usando per sintetizzare il glucosio-6-fosfato e forzando la cellula a far funzionare la glicolisi in modo continuo.
Mutazione nei geni e causa di malattie. Sono mote mutazioni nel DNA mitocondriale che causano una malattia nota come neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON).
Questa rara malattia genetica colpisce il sistema nervoso centrale compresi i nervi ottici, determina la perdita della visione bilaterale ed ha esito molto rapido nei giovani. La sostituzione di una singola base nel gene mitocondriale ND4 porta all’incorporazione, nella proteina del complesso IU, un residuo di His al posto del residuo di Arg; i mitocondri colpiti da questa mutazione son in parte incapaci di trasferire elettroni dal NADH al coenzima Q.
Anche se questi mitocondri sono capaci di produrre ATP trasferendo elettroni all’ossigeno, non sembrano sufficientemente efficaci nel rifornire opportunamente il metabolismo molto rapido dei neuroni, il risultato di questa carenza è il danno del nervo ottico che porta alla cecità. Un’altra malattia genetica umana, l’epilessia mioclonica e malattie delle fibre rosse logore (MERRF) è causta da una mutazione del gene mitocondriale che codifica per un RNA transfer.
Questa malattia causata da scatti muscolari non controllabili è apparentemente il risultato della produzione difettosa di alcune proteine sintetizzate con l’aiuto di RNA transfer mitocondriali. Le fibre del muscolo schelettrico dei pazienti effetti da MERRF hanno mitocondri di forma anormale che in qualche caso contengono strutture paracristalline.
Si rimette la mappa del DNA dei mitocondri umani che mostra i geni che codificano per le proteine del complesso I.
La NADH deidrogenasi (da ND1 a ND6).
Il citocromo b del complesso III (Cyt b), le subunità delle citocromo ossidasi (complesso IV) (COI a COIII) e due subunità dell’ ATP sintasi (Atpasi 6 e Atpasi 8).
Sono mostrati anche i geni per gli RNA ribosomiali (rRNA) e per un certo numero di RNA transfer specifici dei mitocondri.
Le frecce indicano posizioni in cui sonoi note le mutazioni della sequenza di basi che causano le patologie LHON e MERRF; i numeri tra parentesi indicano la posizione della base modificata; il nucleotide 1 è in alto.